Потенциальное влияние и стратегии преодоления HEPES на развитие цвета индикатора фенолового красного

В клеточных культурах и биологических экспериментах,Буфер HEPESи феноловый красный индикатор часто используются одновременно. Первый используется для поддержания стабильности pH в культуровой среде, в то время как второй используется для визуального отображения изменений pH.взаимодействие между ними с точки зрения химических свойств может привести к аномалии цветаВ статье будут проанализированы причины этого явления и предоставлены упрощенные решения по оптимизации.

Химическая основа интерференции цвета

Феноловый красный цвет чувствителен к pH и меняет цвет в зависимости от кислотности или щелочности: он выглядит желтым в кислой среде (pH < 6,8), красным в нейтральной среде (pH ≈ 7,4),и фиолетового красного цвета в щелочной среде (pH> 8.2) Эта характеристика делает его идеальным инструментом для мониторинга рН клеточных культур.

Основная функция HEPES как буфера заключается в стабилизации pH путем высвобождения или поглощения ионов водорода.Проблема в том, что группы сульфоновой кислоты в молекулах HEPES имеют схожую химическую структуру с красным фенолом., и когда концентрация HEPES высока, они будут взаимодействовать с красным фенолом, чтобы изменить его молекулярную структуру.Это изменение приводит к тому, что красный цвет фенола становится светлее или меняется при определенном pH, например, он может выглядеть оранжево-красным вместо стандартного красного при pH 7.4.

Интуитивное проявление феномена интерференции

При обычной клеточной культуре, если одновременно используются высокие концентрации HEPES (например, более 20 мммоль/л) и фенол красного цвета, цвет культуры может быть более светлым или желтоватым, чем ожидалось.Например, культура с pH 7,4, которая должна была показаться красной, может стать бледно-оранжевой из-за вмешательства HEPES, что приводит исследователей к неправильному оценке значения pH.

При наблюдении флуоресцентной микроскопией это вмешательство более выражено.в результате снижения яркости изображения или повышения фонового шумаЭтот эффект особенно заметен в долгосрочных наблюдениях или экспериментах с визуализацией живых клеток, которые могут маскировать истинное состояние клеток.

Упрощенный план оптимизации

Настройка концентрации HEPES

1. Обычное выращивание: контролировать концентрацию HEPES в пределах 10-15 мммоль/л, что имеет минимальное помеха в развитии цвета фенол-красного и может эффективно поддерживать стабильность pH.

2Краткосрочный эксперимент: если время эксперимента короткое (например, <4 часа), концентрацию HEPES можно еще больше уменьшить до 5 мммоль/л или добавить только при необходимости.

3. Чувствительные клетки: для клеток, которые чрезвычайно чувствительны к изменениям pH (например, нейронов), рекомендуется использовать бикарбонатную буферную систему вместо HEPES или полностью удалить фенол красный.

Альтернативные методы цветопередачи

1. Фенол-красная свободная культура: для экспериментов, требующих высоких концентраций HEPES, может быть выбрана культура без фенол-красного,для контроля кислотности и щелочности могут использоваться пробирки pH или электронные pH-измерители.

2. Флуоресцентные зонды: используя флуоресцентные красители, такие как BCECF-AM, вместо фенольного красного, эти зонды не подвержены воздействию HEPES и могут обеспечить более точные измерения pH.

3. Коррекция цвета: если HEPES и фенол красный должны использоваться одновременно, стандартная кривая может быть подготовлена заранее для коррекции наблюдаемого отклонения цвета с помощью колориметрического метода.

Оптимизация экспериментального дизайна

1. Степенированное буферирование: используйте HEPES для поддержания pH на стадии предкультуры клеток и переходите на культурологическую среду без HEPES перед визуализацией, чтобы уменьшить помехи.

2. Выбор длины волны: при флуоресцентном изображенииизбегайте основной длины волны абсорбции фенолового красного (например, 560 нм) и выбирайте более длинный флуоресцентный канал длины волны (например, 633 нм), чтобы уменьшить интерференции фона.

3Контрольная установка: для каждого эксперимента была создана контрольная группа без HEPES для визуального сравнения цветовых различий.

Понимая механизм взаимодействия между HEPES и красным фенолом,исследователи могут легко регулировать экспериментальные условия, чтобы обеспечить надежность результатов развития цвета при сохранении стабильности системы культурыДля сложных экспериментов рекомендуется сначала провести небольшие предварительные эксперименты для проверки эффективности схемы оптимизации.

Hubei Xindesheng Material Technology специализируется на производстве HEPES и другихбиологические буферные агентыПродукты имеют высокую чистоту, хорошую буферную способность и доступные цены, обеспечивая продуктовую поддержку для связанных экспериментов.Пожалуйста, свяжитесь со мной.!